Эффект пломбировочных материалов in vitro на рост E. Faecalis

Ирис Слуцкий – Гольдберг, доктор стоматологии, бакалавр медицинских наук; Хагей Слуцкий, доктор стоматологии, бакалавр медицинских наук; Михаель Соломонов, доктор стоматологии, бакалавр медицинских наук; Шломо Маталон, доктор стоматологии.

Резюме

Целью настоящего исследования было оценить эффект различных пломбировочных материалов на рост Enterococcus Faecalis.

Антибактериальные свойства AH plus, Apexit Plus, Epiphany SE и RoekoSeal были исследованы с использованием агаро-диффузионного теста (АДТ) и прямого контактного теста (ПКТ). Материалы изучали либо в свежеприготовленном состоянии, либо после полимеризации (1-14 дней).

При проведении АДТ пломбировочный материал на основе гидроксида кальция (Apexit Plus) обнаружил значительную зону подавления, в то время как материал на основе смолы (AH-plus) обнаружил минимальную зону подавления. При проведении ПКТ пломбировочный материал на основе гидроксида кальция оказывал кратковременный антибактериальный эффект в течение 1 дня, в то время как новая адгезивная система для пломбирования корневых каналов Epiphany SE способствовала бактериальному росту в течение, по крайней мере, 7 дней.

Выводы: новая бондинг-система может стимулировать рост бактерий, и это является возможным объяснением бурного размножения E. faecalis в присутствии Epiphany.

Ключевые слова: агаро-диффузионный тест, прямой контактный тест, E. Faecalis, эндодонтические пломбировочные материалы.

Введение

Одной из основных целей эндодонтического лечения является полное удаление микроорганизмов из системы корневого канала. Это достигается путем механической очистки и придания формы и дополняется использованием антибактериальных ирригантов, адекватным пломбированием свободного пространства и возможным применением антимикробных повязок между посещениями (1,2). Однако лечение может уменьшить, но не обязательно устраняет корневую инфекцию (3-5). Таким образом, пломбирование корня должно воспрепятствовать повторному инфицированию коронки (6) и проникновению бактерий в апикальные части зуба и герметично изолировать сохранившиеся бактерии внутри каналов (7,8).

Хотя различные виды Enterococcus обычно составляют лишь малую долю исходной флоры в необработанных корневых каналах (9), этот род наиболее часто выделяют из корневых каналов зубов после их неудачной обработки (10,11).

Гроссман доказывал, что идеальный пломбировочный материал для корневых каналов должен быть бактериостатическим, и, действительно, было показано, что некоторые эндодонтические пломбировочные материалы обладают антимикробной активностью (8).

В прошлом антимикробная активность пломбировочных материалов для корневых каналов оценивалась с использованием агаро-диффузионного теста (АДТ). Однако эта методика является относительно нечувствительной, а ее результаты зависят от диффузии и физических свойств исследуемых материалов (12). Прямой контактный тест (ПКТ) был разработан для преодоления этих ограничений. ПКТ использовался для оценки антибактериальной активности in vitro многочисленных эндодонтических пломбировочных материалов, таких как цинка - оксид эвгенольный цемент (ZOE), пломбировочных материалов на основе смол и пломбировочных материалов, содержащих гидроксид кальция (13).

Недавно на рынке появилась новая обтурационная система на основе термопластичного полимера - Resilon/Epiphany (Pentron, Валлингфорд, Коннектикут, США) в качестве альтернативы гуттаперче. Возможным предполагаемым преимуществом использования этой системы перед общепринятой методикой пломбирования каналов с использованием гуттаперчи и герметика является образование «моноблока» без типичных лакун в корневых пломбах на основе гуттаперчи (14).

Однако этот факт не был подтвержден другими исследованиями, которые показали, что в корневых каналах, запломбированных материалом Resilon, не наблюдалось меньшего проникновения микробов, чем при использовании гуттаперчи (15,16); более того, Тay et al показали, что Resilon является чувствительным к щелочному гидролизу (17).

Целью настоящего исследования было сравнение противомикробного эффекта материала Epiphany с активностью трех других пломбировочных материалов для корневых каналов против E. faecalis с использованием АДТ и ПКТ.

Материалы и методы

Исследованные материалы

Было исследовано четыре пломбировочных материала для корневых каналов. Это были: материал на основе эпоксидной смолы: AH plus® (Dentsply International Inc., Йорк, Пенсильвания, США); материал на основе гидроксида кальция: Apexit Plus ® (Vivadent, Шаан, Лихтенштейн); материал на основе смолы: Epiphany SE (Pentron Clinical Technologies LLC, Валлингфорд, Коннектикут, США); материал на основе гуттаперчи и оксида цинка: RoekoSeal (Coltène/Whaledent, Альтштеттен, Швейцария).

Исследованный микроорганизм и условия его роста

Выделенный в клинических условиях E. faecalis выращивали в аэробных условиях из замороженных исходных культур при 37ºС в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США), содержавшем 1,25% стрептомицина.

АДТ выполняли с использованием чашек Петри с агаром. Каждую чашку инокулировали 200 мкл свежевыращенного E. faecalis (оптическая плотность [OD] при 650 нм = 0,5) с равномерным распределением инокулята стеклянной палочкой Драгальского. Для исследования парных проб в агаре выдавливали восемь углублений, каждое из которых имело диаметр, равный 4 мм.

Каждый исследуемый материал перемешивали и сразу же вносили в каждое выдавленное углубление, полностью заполняя его. После инкубации при 37^оC в течение 72 часов чашки изучали на предмет наличия зоны подавления. С помощью штангенциркуля Digimatic (Mitutoyo Corporation, Канагава, Япония) делали два взаимноперпендикулярных замера диаметра зоны подавления. АДТ повторяли три раза.

Прямой контактный тест основан на турбидиметрическом определении бактериального роста в планшетах для микротитрования с 96 лунками (Nunclon, Nunc, Копенгаген, Дания). Кинетика роста в каждой лунке регистрировалась при длине волны 650 нм в течение 16 часов через каждые 30 минут с использованием спектрофотометра с регулируемой температурой, установленного на 37°C (VersaMax, Molecular Device Corp, Menlo Oaks Corp Center, Menlo Park, Калифорния, США).

E. faecalis по своей природе является устойчивым к стрептомицину, и поэтому эти антибиотики добавляли к культуральной среде и к буферам для предотвращения микробного загрязнения во время экспериментов. Автоматическое перемешивание перед каждым считыванием результата обеспечивало гомогенную суспензию бактериальных клеток.

Экспериментальное оборудование для ПКТ было таким, как описано Weiss и др. (13). 10 мкл бактериальной суспензии (0,9-1,1 х 10⁶ колониеобразующих единиц) наносили на исследуемый материал, при этом пластина оставалась в вертикальном положении. Испарение жидкости из суспензии обеспечивало прямой контакт между бактериями и исследуемыми материалами, который имел место в течение 1 часа при 37°C.

Затем в каждую лунку добавляли бульон с сердечно-мозговой вытяжкой, содержавший 1,25% стептомицина (235 мкл), и осторожно перемешивали в течение 2 минут (встряхиватель Gyrotory, New Brunswick Scientific Co, Эдисон, Нью-Джерси, США). 15 мкл суспензии затем переносили из лунок с покрытием из исследуемых материалов (группа А), в соседний ряд из 8 соответствующих лунок, содержавших 205 мкл свежей среды (группа Б).

Это обеспечивало два набора из 8 лунок для каждого исследуемого материала, содержащих равные объемы жидкой среды (220 мкл); таким образом, рост бактерий можно было контролировать и сравнивать либо в присутствии, либо в отсутствие исследуемого материала. Отсутствие роста в лунках группы А и рост в соответствующих лунках группы Б свидетельствует о бактериостатической активности, в то время как отсутствие роста в обеих группах свидетельствует о бактерицидной активности.

Восемь лунок без покрытия в том же планшете для микротитрования служили положительным контролем.

Идентичный бактериальный инокулят наносили на стенки лунок без покрытия и обрабатывали их так же, как и экспериментальные лунки.

Отрицательный контроль представлял собой набор лунок с таким же покрытием из исследуемых материалов, как и в экспериментальных лунках, и содержавших такие же объемы среды без инокулята.

Затем пластину инкубировали при 37°C в устройстве для считывания микропланшетов VersaMax и в течение 16 ч контролировали оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 650 нм.

Полученные данные представляли в виде полулогарифмических кривых роста. Линейную часть кривой, которая коррелирует со скоростью бактериального роста, переносили и выражали в виде линейной математической формулы. При оценке углового коэффициента в этих линейных формулах применяли двухфакторный анализ ANOVA, однофакторный анализ ANOVA и методики множественного сравнения Тьюки.

Аналогичные эксперименты были выполнены в условиях, когда исследуемым материалам давали возможность стареть в течение 1, 2, 7 и 14 дней соответственно в присутствии фосфатного буферного раствора, содержавшего антибиотики, который заменяли через каждые 48 ч.

Эксперименты повторяли последовательно 7 раз.

Результаты

RoekoSeal не обнаружил какого-либо ингибирования роста бактерий.

Аpexit Plus обнаружил значительную зону ингибирования (в среднем, 3,1мм ± 0,2) в агаро-диффузионном тесте (АДТ) через 72 часа; AH plus показал минимальную зону ингибирования (в среднем, 0,1мм ± 0,05), тогда как Epiphany SE и …

ПКТ был выполнен на 8 образцах каждого из 4 исследованных материалов. Двухфакторный анализ АNOVA, проведенный по всем экспериментам, показывает достоверное различие в скорости роста бактерий (угловой коэффициент) для комбинации времени и материала (P<0,001).

При исследовании роста E. faecalis сразу же после нанесения материалов Apexit Plus был единственным материалом, который обнаружил сильные антибактериальные свойства. Аpexit Plus оказывал бактериостатический эффект, поскольку наблюдался рост бактерий в лунках группы Б, сходный с ростом в контрольных лунках. Все остальные материалы не проявили каких-либо антибактериальных свойств (Таблица 1, Рисунок 1).

После старения материалов в течение 1 дня Apexit Plus сохранял свои антибактериальные свойства (Таблица 1).

Apexit Plus, AH plus и RoekoSeal не отличались от контроля после старения материалов в течение 2 дней, в то время как Epiphany SE усиливал рост бактерий (Таблица 1, Рисунок 2).

После старения материалов в течение 7 дней Epiphany SE по-прежнему обладал способностью усиливать рост бактерий, все другие материалы были подобны контролю (Таблица 1).

Старение материалов в течение14 дней показало отсутствие какого-либо взаимодействия между бактериями и материалом (Таблица 1).

Обсуждение

Для данного исследования в качестве тест-организма был выбран E. faecalis, который часто связан с хроническим апикальным периодонтитом, и который бывает трудно удалить из корневых каналов.

Имеются многочисленные пломбировочные материалы для корневых каналов, основанные на различных композициях. Идеальный пломбировочный материал для корневых каналов должен быть либо инертным и безусадочным, либо обладать достаточной противомикробной активностью и низкой токсичностью для окружающих тканей (8, 18). Поэтому антибактериальная активность пломбировочных материалов для корневых каналов в отношении факультативно анаэробного микроорганизма E. faecalis может способствовать борьбе с инфекцией.

Предшествующее исследование показало, что данные, полученные при использовании АДТ, и результаты, полученные при использовании ПКТ, могут не совпадать (13). Наши результаты согласуются с этой оценкой, поскольку в двух тестах были получены противоречивые результаты. Пломбировочные материалы, оценивавшиеся в данном исследовании, показали различные ингибирующие эффекты в зависимости от основы пломбировочных материалов и типа использованного теста.

Apexit plus представляет собой материал на основе гидроксида кальция. Пломбировочные материалы для корневых каналов с включением гидроксида кальция обладают повышенной антибактериальной активностью (19, 20). Антимикробный эффект этого пломбировочного материала обусловлен высвобождением гидроксильных ионов, которые повышают рН до значений более 12,5. Когда пломбировочный материал на основе гидроксида кальция затвердевает, рН снижается приблизительно до 9,14, что приводит к потере эффективности (21).

При проведении обоих тестов Apexit Plus показал более высокую антибактериальную активность, и он был более эффективным против исследованного организма, чем другие материалы, как сразу после смешивания, так и по истечении двух дней.

Эти результаты лишь частично совпадают с результатами Eldeniz и др., которые не смогли обнаружить антибактериального эффекта в АДТ, но показали антибактериальный эффект в ПКТ, как непосредственно после смешивания, так и через 24 часа (19).

Эти результаты поддерживают утверждение о том, что метод АДТ не является надежным методом для изучения антибактериальных свойств материалов на основе гидроксида кальция, поскольку это вещество обладает низкой растворимостью и может медленно диффундировать в агар.

Антибактериальный эффект пломбировочных материалов на основе эпоксидной смолы может быть связан с бисфенол-А-диглицидиловым эфиром, который был ранее идентифицирован как мутагенный компонент (22), или с высвобождением формальдегида во время процесса полимеризации (23). В предшествующем исследовании, проведенном Siqueira и др., AH plus показал некоторый антибактериальный эффект в отношении E. faecalis при использовании АДТ (24). Действительно, в настоящем исследовании пломбировочный материал AH Plus проявлял слабый противомикробный эффект в отношении E. faecalis, возможно, в связи с тем, что с течением времени высвобождается лишь минимальное количество формальдегида (23). Это согласуется с результатами, полученными Mickel и др., которые показали, что AH plus не обладал противомикробной активностью в отношении E. faecalis (25).

Недавно в качестве эндодонтического материала для пломбирования каналов был разработан термопластичный синтетический материал на основе сложного полиэфира (сополимера поликапролактона и уретана диметакрилата) (Resilon). Resilon заменяет гуттаперчевые штифты, при этом обеспечивая те же свойства пломбировочного материала при обработке и улучшенные характеристики сцепления.

В обтурационной системе Epiphany используются штифты из материала Resilon и пломбировочный материал двойного отверждения на основе смолы, который связывается и с корневым дентином, и со штифтами из материала Resilon (14).

Разработчики пломбировочного материала Epiphany утверждают, что этот пломбировочный материал для корневых каналов представляет собой пломбировочный материала двойного отверждения на основе смолы, который является не мутагенным, не цитотоксичным, биосовместимым, растворимым и менее раздражающим, чем пломбировочные материалы на основе эпоксидной смолы или оксида цинка-эвгенола.

С использованием АДТ Bodrumlu и др. показали, что материал Epiphany обладает меньшей противомикробной активностью, чем четыре других пломбировочных материала (Endomethasone, Sultan, Sealapex и Diaket), за исключением AH 26.

Авторы предположили, что минимальный антибактериальный эффект Epiphany является результатом гидрофильной формы его смолы (26). Те же результаты можно извлечь из данных, полученных при выполнении АДТ в нашем исследовании; однако результаты ПКТ существенно отличались.

Этот материал не только не является антибактериальным, он способствует росту бактерий. Когда изучались характеристики растворимости ряда эндодонтических пломбировочных материалов, материал Epiphany показал самую высокую кажущуюся сорбцию воды (8%), по сравнению с EndoREZ (3,0%) и AH Plus (1,1%) (27). В спецификациях Американской стоматологической ассоциации для эндодонтических пломбировочных материалов требуется растворимость <3%.

Эти результаты могут объяснить разницу в данных, полученных при проведении АДТ, с результатами ПКТ. В среде полости рта эти материалы могут абсорбировать воду и элюировать свободные (не прореагировавшие) мономеры (28). Высвобождение этих не прореагировавших мономеров из композитов смолы может стимулировать рост бактерий (29-31); это дает возможность объяснить большое количество E. faecalis в присутствии Epiphany.

RoekoSeal представляет собой пломбировочный материал для корневых каналов на основе силикона. В настоящем исследовании RoekoSeal не показал какого-либо ингибирования роста бактерий при проведении АДТ и ПКТ. Эти результаты только частично согласуются с результатами Cobankara и др., которые изучали антибактериальные свойства RoekoSeal с использованием АДТ и ПКТ и показали, что в АДТ RoekoSeal не проявлял антибактериальной активности, в то время как другие пломбировочные материалы - Ketac-Endo, Sultan и AH Plus - были более мощными ингибиторами роста бактерий (32).

Было выявлено, что разные пломбировочные материалы обладают различными антибактериальными свойствами в зависимости от своего состава, теста, в котором они оцениваются, и времени. Результаты дают основание полагать, что использование Epiphany может создавать проблемы, и что применение пломбировочных материалов с антибактериальным материалом может давать преимущества.

Тем не менее, такие результаты следует рассматривать с осторожностью и оценивать с учетом других свойств, например – изменения герметизирующей способности этих материалов с течением времени, поскольку материалы, которые обладают некоторыми противомикробными свойствами, могут постепенно уменьшать свой объем, за счет чего ухудшается качество пломбы (21).

Кроме того, представленные выше данные касаются условий in vitro, и исследование антибактериальной активности in vivo может дать другие результаты, поскольку количество жидкости в корневом канале ограничено, и антибактериальный эффект герметика может зависеть от способности материала проникать в дентинные канальцы после удаления инфицированного слоя и достигать скрытых в них бактерий.

Рис. 1. Рост Enterococcus faecalis после прямого контакта со свежим материалом. Каждая точка на кривой представляет среднюю оптическую плотность в логарифмическом масштабе при одновременном измерении в 8 отдельных лунках.

Рис. 2.Рост Enterococcus faecalis после прямого контакта с материалом, который подвергался старению в течение 7 дней в фосфатном буферном растворе. Каждая точка на кривой представляет среднюю оптическую плотность в логарифмическом масштабе при одновременном измерении в 8 отдельных лунках.

Таблица 1. Скорость роста бактерий: скорость роста Enterococcus faecalis, отображаемая угловым коэффициентом линейного участка кривой роста. Каждое число в таблице представляет среднюю оптическую плотность (log) ± стандартное отклонение для углового коэффициента кривой бактериального роста в восьми отдельных лунках на одном и том же планшете для микротитрования. Числа, выделенные жирным шрифтом, представляют значения, которые достоверно не отличаются (сравнение Тьюки).

Время Материал	Свежий материал	1 день	2 дня	7 дней	14 дней
Apexit plus	0,0017+0,0012	0,0004+0,0003	0,091+0,2525	0,114+0,0094	0,0718+0,0087
AH plus	0,079+0,0064	0,0658+0,0291	0,0581+0,0072	0,1028+0,0256	0,0742+0,0172
RoekoSeal	0,0698+0,0039	0,0544+0,0132	0,0531+0,0288	0,082+0,0043	0,051+0,0057
Контроль	0,0893+0,0055	0,073+0,004	0,0845+0,0007	0,099+0,0101	0,091+0,0371
Epiphany SE	0,087+0,0069	0,0905+0,0204	0,2335+0,0954	0,1924+0,019	0,0302+0,0379
Уровень достоверности	Р<0,0001	Р<0,0001	Р<0,0001	Р<0,001	№

Автор:  Ирис Слуцкий – Гольдберг, доктор стоматологии, бакалавр медицинских наук; Хагей Слуцкий, доктор стоматологии, бакалавр медицинских наук; Михаель Соломонов, доктор стоматологии, бакалавр медицинских наук; Шломо Маталон, доктор стоматологии